تقنيات التعديل الوراثي للنباتات

إعداد
د. يوسف طريفة
المعهد القومي للعلوم الفلاحية
الجمهورية التونسية

سنبدأ المحاضرة بالتعريف بالتركيب للهيكل الجيني الذي سيتم إدخاله في النباتات إذ أن إفراز المواد المحورة تتركز على معرفة دقيقة للهيكل المدخل، ثم نتعرف على طرق التحوير (التعديل) الجيني للنباتات الأكثر رواجا وهى تقنية استعمال البكتيريا agrobacterium والطريقة التي تستعمل آلة معروفة باسم مسدس الجينات أو gene gun or biolistic
ثم نناقش بعض الطرق المستعملة حاليا لإفراز وتقدير كميات الموارد المحورة وراثيا حيث أن العديد من الدول تسمح بدخول المواد المحورة كما أوصت بضرورة إرشاد المستهلك متى فاقت كمية الموارد المحورة في أي خليط ما.

يتكون الهيكل الجيني من عدة مقومات ولعل أهمها هو الموروثة التي سوف توجه إنتاج البروتين التي يرغب إدخالها في النبتة المحورة. وتكون هذه المورثة تحت مراقبة جهاز أو promoter الذي سيضبط قوة ومكان استنساخ(Trancription) المورثة . وهنالك أيضا منطقة توجد بعد المورثة وهدفها وقف عملية الاستنساخ، والهيكل المدخل يتكون أيضا من مورثة ثانية لإنتاج مادة تستعمل لانتقاء النباتات المحورة من بين النباتات التي لم تتغير جينيا عند تطوير هذه النباتات المحورة.
ثم يتم بالطبع إدخال هذا الهيكل في كروموزوم النبتة والملاحظ هنا أن هذا سيؤدي إلى إدماج الهيكل في مكان أو أكثر كما لا يمكن التكهن بموقع الإدماج في الكروموزوم.

والملاحظ أيضا انه تم في عديد من الحالات استعمال promoter قوي (35S Promoter) ولا انتقائي فتواجد البروتين المدخل بكمية كبيرة وفي كل أجزاء النبتة. كما تم استعمال منطقة وقف الاستنساخ TNOS في عديد من النباتات المحورة و سنرى لاحقاً أهمية هذه الملاحظة .

الطرق المستعملة للتحوير الجيني للنباتات :

تعتمد الطريقة الأقدم والتي لا تزال تستعمل بكثرة على استعمال بكتيريا اسمها (agrobacterium tunmefaciens) وهذه البكتيريا تسبب مرضا لبعض أنواع النباتات يمكن تشبيهه بمرض السرطان أو تكاثر غير مضبط للخلايا . وخلال التسعينات في القرن الماضي تم اكتشاف أن البكتيريا تسبب المرض عبر إدماجها لمنطقة من حمضها النووي في كروموزوم النبتة. ومن هنا عمل العديد على البحث عن طريق استعمال هذه البكتيريا لادخال موارث جديدة و متعددة نحو النباتات. وحاليا يتم في البداية ادخال الهيكل الجيني في بلسميد(plasmid) وهو حامض نووي دائري مستقل عن الكروموزوم ويتم إدخاله في البكتيريا (agrobacterium) التي تحمل كل الجينات الضرورية لعملية الإدماج في النبتة.

ثم يقع وضع البكتيريا مع النبتة أو أجزاء من النبتة مما ينتج عنه إدماج الوحدة في الحامض النووي في بعض الخلايا للنبتة وليس كلها بالطبع.

ومن هنا يجب انتقاء الخلايا المحورة جينيا بتربية الأنسجة على وسط غذائي (Culture media) يحتوي على المضاد الحيوي (antibiotic) إذ أن الهيكل الجيني يحتوي على مورثة الانتقاء والتي تتسبب في إنتاج بروتين مقاوم للمضاد الحيوي بينما تموت الخلايا التي لم يقع تحورها. وهكذا يتم إحياء نباتات من الخلايا المنتخبة .

وقد تم استعمال هذه الطريقة لتحور العديد من النباتات ولكن لم يكن من الممكن تحوير بعض الأصناف كالحبوب فهذا أدى إلى تطوير طريقة جديدة منذ سنة 1987 تعرف باسم ال biolistic وتستعمل آلة سميت بمسدس الجينات، ويتم في هذه الحالة تغليف كرات صغيرة الحجم بالوحدة الجينية أو الهيكل الجيني وبعد ذلك يتم إدخال الكرات في الخلايا عن طريق مدفع يعمل بهواء أو هيليوم مضغوط ، وهذا يؤدي إلى موت العديد من الخلايا ولكن البعض منهم لا يموت ومن بين الخلايا التي نجت يتم إدماج الوحدة الجينية.

وبالطبع هنا أيضا يتم انتقاء الخلايا المحورة جينيا بتربية الأنسجة على وسط غذائي (Culture media) حاوي للمضاد الحيوي (antibiotic) ، وفي مسدس الجينات توضع الكرات المغلفة بالوحدة الجينية و توضع أقراص من النبتة ويقع بعد هذا قذف الكرات.

في العديد من البلدان تم اتخاذ قرارات تنص على تصنيف المواد الغذائية وضرورة البحث عن المواد المحورة جينيا ففي السوق الأوروبية المشتركة يجب إعلام المستهلك بان المادة الغذائية تحتوي على مواد محورة لما تفوق هذه المواد نسبة 1% من أي نوع من العناصر. ومن هنا تم تطوير طرق لإفراز مواد محورة الموارث وطرق لتقييم المواد المحورة الموارث، وهنالك طرق الكشف عن البروتين وطرق الكشف عن الحامض النووي.

وتعتمد الطرق المرتكزة عن الكشف عن البروتين على استعمال أجسام مضادة موجهة ضد البروتين المنتجة من المورثة المدخلة ( (Antibodies، فيقع تثبيت المضاد الأول الذي يتركز عليه البروتين المدخل ثم يتم تركيز مضاد يحمل أنزيم وبهذا يمكن اكتشاف وجود البروتين المنتجة من الجين المدخل.
وقد تم تطوير طريقة تسمى بطريقة الضمادات لإفراز المواد المحورة ، ففي بادئ الآمر يتم طحن المادة الغذائية في سائل ثم يتم وضع الضمادة ومن هنا نجد حالتين: فإما أن تكون المادة تحتوي على مواد محورة وفي هذه الحالة يمكن رؤية خط ملون في منطقة يوجد بها المضاد للبروتين المدخل وإما أن لا تحتوي العينة على موارد محورة وهنا لا يمكن تطور اللون إلا في منطقة يوجد بها مضاد لبروتين موجود في كل النباتات سواء كانت محورة أم لا.

وهذه التقنية أو الطريقة لها بالطبع بعض الايجابيات و بعض السلبيات ، فهي طريقة سريعة وقليلة التكلفة وطريقة سهلة تستعمل لإفراز كل النباتات المحورة والمنتجة لنوع خاص من البروتين ولكن لا يمكن استعمالها لتعيين المادة المحورة إذ أن العديد من النباتات المحورة والمختلفة قد تنتج نفس البروتين.

إن مجال الاستعمال محصور إذ يجب إنتاج الأجسام المضادة كما لا يمكن استعمال هذه التقنية مع المواد المصنعة حيث تكون البروتين مستنسخة .

أما مجموعة الطرق الأخرى لإفراز تقدير المواد المحورة فإنها ترتكز على البحث في النباتات عن الوحدة الجينية المدخلة ، وقد تم استعمال تقنيات كثيرة لهذا الغرض كتقنية Southern Blot أو تقنيات الرقاقات DNA Chips ، ولكن تقنية الإجماع (PCR) تبقي الأكثر رواجا ومبدأ هذه التقنية هو إكثار منطقة معينة من الحامض النووي.

المراحل في هذه التقنية هي الأتي :

يتم فتح الحامض النووي برفع درجة الحرارة ثم يتم تثبيت بادئ (Primer) وأخيرا يقع تصنيع الحامض النووي الجديد وذلك بفضل أنزيم اسمه Taq polymerase
يتم إعادة هذه المراحل 35 إلى 45 مرة مما ينتج عنه إكثار المنطقة المحصورة ما بين البادئين (Primers) و هكذا يمكن رؤية هذا الحامض.

وهذه الطريقة لها عديد من الايجابيات ، فهي طريقة سهلة التطبيق على عديد التحويرات الجينية وطريقة حساسة ومجال استعمالها واسع وتبقي الطريقة الأكثر رواجا.

يمكن استعمال هذه التقنية في حالتين كطريقة للانتقاء (Screening) أو للتعين (identificatioon) ، ففي طريقة الانتقاء يتم إكثار منطقة قد تكون مشتركة في أكثر من حدث محور جينيا فعلى سبيل المثال يقع إكثار منطقة 35S Promoter التي استعملت بكثرة في النباتات المحورة جينيا .
أما في طريقة التعين فيقع إكثار مناطق خاصة بتحوير جيني معين, وهذا الأمر مهم جدا إذ أن في بعض القوانين قد يسمح بتجارة مادة محورة وراثياً بتحوير معين معروف ولكن لا يسمح بتجارة مادة محورة بتحوير أخر ، رغم أن هذين لهم نفس الموروثة المدخلة او نفس الـPromoters .

وعمليا يقع تقسيم العينة واستخراج عينة العمل حسب القوانين والضوابط المعدومة فمثلا عند تحليل البذور يجب استخراج 10000 بذرة, ثم يتم طحن العينة و مزجها ثم يقع استخلاص 100غ طحن ثانوي للعينة ويتم استخراج الحامض النووي من 2 أو 3 عينات ومن هنا يتم مراجعة كمية وجودة الحامض النووي المستخرج وأخيرا تتم عملية الإجماع أو التكثير .

المراجع

Liste Bibliographique :
1. Ahmed, F. E. Detection of genetically modified organisms in foods. Trends in Biotechnology. 2002, 20, 215-233.
2. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K., J. and Williams, P., M. Real-time quantitative PCR. Genome Res. 1996, 6, 986-994.
3. Hübner, P., Waiblinger, H-U., Pietsch, K. and Brodmann, P. Validation of PCR Methods for quantitation of Genetically modified Plants in food. Journal of AOAC International. 1996, 84, 1855-1864.
4. Plant gene transfer and expression protocols/ Edited by Heddwyn Jones. In Methods in Molecular Biology, Volume 49. Humana Press, Totowa, New jersey.
5. Principes des techniques de biologie moléculaire. Denis Tagu Ed. Editions de l’INRA Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France.

من أوراق حلقـة العمل حـول تقييم الآثار البيئيـة لإدخال الأنـواع النباتيـة والحيوانية المحـورة وراثياً فــي المنطقة العربية، والتي نظمتها المنظمة العربية للتنمية الزراعية في عام 2003 في الخرطوم.